活細胞分析試劑盒包含 488 Caspase-3底物和Ac-DEVD-CHO Caspase-3/7抑制劑。 488 Caspase-3 Substrate為基于Caspase-3/7活力檢測細胞凋亡提供了有效的工具，適用于熒光顯微觀察和流式細胞儀分析。

相較于其它基于（FLICA）分析的 Caspase 的熒光底物或熒光抑制，試劑盒內(nèi)提供的Substrate 檢測Caspase-3/7 活性的同時不會抑制完整細胞的凋亡過程。Substrate由耦合Caspase-3/7 DEVD識別序列的熒光DNA染料組成。Substrate 最初無熒光，其會穿過細胞膜進入細胞質(zhì)。在凋亡細胞中Caspase-3/7剪切Substrate釋放高親和性的DNA 染料，這種染料遷移到細胞核標記DNA 并發(fā)出明亮的綠色熒光。Substrate 是雙功能的，既可以檢測 Caspase-3/7 活性，又能可視化細胞核在細胞凋亡進行中的形態(tài)學變化。

1. 實驗優(yōu)化
下面提供的實驗步驟根據(jù)終點法檢測制度。488 Substrate 可進行細胞長時間孵育過程研究。細胞密度、底物濃度和抑制劑濃度可能需要優(yōu)化。推薦底物濃度1-10 μM之間。細胞可在培養(yǎng)基、PBS或其他的緩沖液中孵育底物。對于貼壁細胞，建議更換新鮮含有底物的培養(yǎng)基，以防背景的不均一性。底物孵育后換液或洗滌細胞等操作可自由選擇。
2. 對照設(shè)定

推薦設(shè)定以下對照：

A. 陰性對照：不誘導凋亡的細胞

B. 陽性對照：誘導凋亡的細胞

C. 抑制劑對照：誘導細胞凋亡同時（或提qian10-30 min）孵育Caspase-3/7抑制劑，最后再添加 488 Caspase-3底物。

3.  抑制劑對照

試劑盒中所提供的Caspase-3/7 抑制劑 Ac-DEVD-CHO 可用來確認Caspase-3/7 依賴于 488 的熒光信號。對于抑制劑對照，抑制劑的終濃度應(yīng)至少是底物濃度的2倍（例如當使用5 μM 488 底物時，Ac-DEVD-CHO濃度為 10 μM）。添加底物前在室溫下孵育Ac-DEVD-CHO 15-30 min，加入底物后，孵育液中繼續(xù)保留抑制劑。Ac-DEVD-CHO 是可逆的競爭性抑制劑。對于某些細胞類型有效的Caspase-3/7 抑制劑需要使用不可逆的抑制劑，如Z-DEVD-FMK，或需要在凋亡誘導之前或誘導過程中添加抑制劑。

4. 流式細胞儀分析

4.1 選擇合適的方法誘導細胞凋亡，未經(jīng)處理的細胞樣本作為對照。

4.2 對于貼壁細胞，實驗前先用胰蛋白酶或其他方法消化細胞。

4.3 用細胞培養(yǎng)基或合適緩沖液重懸細胞，使細胞密度達到106個/mL數(shù)量級。

4.4 添加200 μL 細胞懸液至流式細胞試管。

4.5 抑制劑對照樣本，用Ac-DEVD-CHO 處理細胞（見上文）。

4.6 200 μL細胞懸液中加5 μL 0.2 mM 的Substrate并立即混勻使底物濃度為5 μM。不同類型細胞最佳底物濃度可能不同，需進一步優(yōu)化。

4.7 室溫避光孵育15-30 min。

4.8 加入300 μL細胞培養(yǎng)基或PBS，使用流式細胞儀分析，選擇檢測綠色熒光的通道（激發(fā)/發(fā)射：485/515 nm）。

5. 熒光顯微鏡觀察

5.1 選擇合適的方法誘導細胞凋亡，未經(jīng)處理的細胞樣本作為對照。

5.2 抑制劑對照樣本，用Ac-DEVD-CHO 處理細胞（見上文）。

5.3 用含5 μM Substrate 的新鮮培養(yǎng)基或PBS對細胞進行換液（見試驗優(yōu)化）。對于抑制劑對照組，抑制劑與底物一同孵育。

5.4 室溫孵育30 min 或更長時間。

5.5 PBS或其它緩存液清洗細胞，熒光顯微鏡觀察細胞，使用觀察綠色熒光的濾片（激發(fā)/發(fā)射：485/515 nm）。

6. 熒光酶標儀檢測

6.1 將貼壁細胞生長在黑色96孔板中；對于懸浮細胞，調(diào)整密度至106個/mL，每孔加入0.2 mL細胞懸液。

6.2 選擇合適的方法誘導細胞凋亡，未經(jīng)處理的細胞樣本作為對照。（注意：細胞可能在管或瓶中處理，然后轉(zhuǎn)移到 96孔檢測板。）

6.3 抑制劑對照樣本，用 Ac-DEVD-CHO 處理細胞（見上文）。

6.4 對于懸浮細胞，直接添加Substrate 混勻。對于貼壁細胞，用含有5 μM Substrate的新鮮培養(yǎng)基或PBS對細胞進行換液（見試驗優(yōu)化）。對于抑制劑對照組，抑制劑與底物一同孵育。

6.5 細胞可以在含有Substrate 的培養(yǎng)基中直接觀察。

6.6 對于懸浮細胞，輕輕震蕩重懸細胞。熒光酶標儀設(shè)置激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長520 nm。建議貼壁細胞使用底部閱讀方式。貼壁細胞密度的變化可能導致不準確的讀數(shù)。

運輸及保存方法